大家好，今天推送的文章发表在International Journal of Biological Macromolecules上的“Immobilization of cross-linked enzymes aggregates on hierarchical covalent organic frameworks: Highly stable chemoenzymatic nanoreactor for asymmetric synthesis of optically active halohydrins”，通讯作者为河北工业大学化学工程与技术学院的姜艳军教授。
有机金属催化剂广泛应用于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（磷酸）辅因子的非酶再生，但在与酶的一锅反应中可能相互失活。在这项工作中，作者提出了一种分级多孔COFs（HP-TpBpy），使用甲酸作为氢化物供体的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）再生中表现出优异的性能，并将发酵乳杆菌短链脱氢酶/还原酶1（LfSDR1）交联成酶聚集体（CLEA）并固定在分级Rh-HP-TpBpy上，实现了集成的化学酶催化剂LfSDR1@Rh-HP-TpBpy。其可以催化卤代芳基酮的化学酶还原，并得到相应的具有高转化率和高达99%的对映体过量（ee）值的光学活性卤代醇，并具有优异的使用性能。
生物催化在合成化学中具有重要价值，NAD(P)H的原位再生是实现高效生物催化的关键。电催化和光催化等非酶方法为NAD(P)H再生提供了新的思路，但仍面临酶与催化剂兼容性、稳定性等方面的挑战。[Cp*Rh(bpy)Cl]复合物在NAD(P)H再生中表现出优异的性能，通过优化反应条件，可进一步提高其效率和选择性。未来的研究需要在提高催化剂稳定性、降低成本以及实现更高效的酶与非酶催化剂集成等方面取得突破，以推动生物催化在有机合成中的广泛应用。
1
Rh-HP-TpBpy的制备与表征
集成化学生物催化剂LfSDR1@Rh-HP-TpBpy的合成方法如上图所示。作者为了确认HP-TpBpy的成功合成（图1a），进行傅立叶红外光谱（FT-IR）。如图1b所示，由Hp-TpBpy的固态13C核磁共振（13C NMR）光谱进一步证明（图1c）其成功固定。并通过粉末X射线衍射（PXRD）研究了Hp-TpBpy和Rh-HP-TpBpy的结晶形态，证实了TpBpy即使在制备大孔径并与Rh配合物配位后也具有完整的晶体结构。
作者分别通过氮吸附-解吸实验表征了原始TpBpy、HP-TpBpy和Rh-HP-TpBpy的比表面积和孔径（图2a）。BET表面积从620 m2/g降低到359 m2/g，表明微孔和中孔的减少以及大孔径的形成，如图2b所示。通过乳液聚合制备的聚苯乙烯(PS)珠被用作制造大孔径的硬模板，如图2c-d所示，在与Rh配位后保留了大孔径，确保了物质转移的途径（图2e），TpBpy在孔改性和金属化后保持了高度有序的多孔通道。
作者通过透射电子显微镜（TEM）研究了Rh-HP-TpBpy的形态特征和内部结构，证明了HPTpBpy的均匀通道和大孔径结构。C、N、O和Rh的能量色散X射线光谱（EDS）绘图图像和相应的元素绘图证明了Rh物种在Rh-HP-TpBpy骨架框架内的均匀分布（图3）。
2
NAD(P)H再生性能测试
随后，作者采用甲酸盐存在下的NAD（P）H再生来评价所制备的RhHP-TpBpy的催化性能。如图4a所示，单独的HP-TpBpy和[Cp*RhCl]在NAD（P）H再生反应中均无活性（340 nm处无吸光度）。Rh-HP-TpBpy表现出略高于均相催化剂[Cp*Rh（bpy）（HO）]^2的催化性能，表明其保留了原始活性。其优异性能归因于HP-TpBpy的大孔结构，有利于传质。作者进而制备了无大孔的Rh-TpBpy，其在相同条件下NADH再生效率较低（50分钟内仅达74%），证明孔结构对催化性能有显著影响。通过^1H NMR光谱确认Rh-HP-TpBpy生成的是生物活性的1,4-NADH（6.93 ppm处有特征化学位移），如图4b。
为了提高Rh-HP-TpBpy的NADH再生效率，作者进一步优化了该过程的条件。随着[Cp*RhCl]含量增加，NADH再生产率上升，40 mol%时达到最高。此时Rh-HP-TpBpy中Rh的实际含量为8.46 wt%（通过ICP-OES测定）。最佳甲酸钠浓度为0.4 M，pH为7，温度为30℃。
作者进一步通过实验证明了多相Rh-HP-TpBpy催化剂还使Rh络合物具有更高的稳定性和再循环能力，如图4c所示。在牛血清白蛋白（BSA）存在下，Rh-HP-TpBpy的催化性能优于均相催化剂[Cp*Rh（bpy）（HO）]^2。在5 g/L和20 g/L BSA存在下，Rh-HP-TpBpy的NADH产率分别为69.4%和50.5%，而均相催化剂分别为36.9%和27.9%。Rh-HP-TpBpy在6次循环后仍保持73%的相对活性，表现出良好的稳定性，但存在少量Rh物质泄漏导致活性略有降低，如图4d所示。
而在动力学参数方面，Rh-HP-TpBpy对NADP的Michaelis-Menten常数（KM）值为0.029 mM，低于对NAD的0.053 mM，表明其对NADP亲和力更高。Rh-HP-TpBpy对NAD的周转率（kcat）值为0.019 s^1，高于天然甲酸脱氢酶对NAD的催化活性。Rh-HP-TpBpy的kcat/KM值对NAD为0.358 s^1mm^1，对NADP为0.376 s^1mm^1，对NADP还原的催化效率更高。考虑到NADPH的高价值和价格，Rh-HP-TpBpy具有较高的实际应用价值。
3
一体化化学酶纳米反应器的制备
手性卤代芳醇是重要的医药中间体，酮还原酶驱动的卤代芳基酮不对称还原可用于生产光学活性卤代醇。发酵乳杆菌短链脱氢酶/还原酶1（LfSDR1）是一种高活性、高对映选择性的NADPH依赖性还原酶。作者基于Rh-HP-TpBpy对NADPH再生的优异性能，设计结合LfSDR1和Rh-HP-TpBpy的集成化学酶催化剂。因LfSDR1尺寸大于TpBpy原始孔径，难以物理吸附；TpBpy表面无胺基团，无法通过共价键固定LfSDR1。所以利用Rh-HP-TpBpy的大孔径，通过十字连接酶聚集体（CLEAs）策略将LfSDR1固定在其上。优化交联条件后，获得相对活性为75 U/g的LfSDR1@Rh-HP-TpBpy，活性回收率15%。
为了确定集成化学生物催化剂的成功制备，分别通过FT-IR、PXRD、N2吸附和解吸和XPS对所获得的LfSDR1@Rh-HP-TpBpy进行了研究如图5所示。5a中振动峰的改变归因于LfSDR1的CLEAs中C=N键、-NH和C-N基团。图5b中PXRD图案在3.68°处的衍射减少归因于CLEAs在HP-TpBpy的大孔中的占位，导致BET表面积减少，但弱衍射峰仍显示Rh-HP-TpBpy保留结晶状态，如图5c所示。
作者采用X射线光电子能谱（XPS）表征了LfSDR1@Rh-HPTpBpy中表面元素的化学状态。如图5d所示，在RhHP-TpBpy的宽光谱中观察到对应于Rh元素的新峰。如图5e所示，Rh-HP-TpBpy的N 1s光谱中，C-N=C峰向更高结合能（399.0 eV）正移，表明Rh与Bpy单元共轭；398.3 eV处的N-Rh键特征峰证实Rh在N位联吡啶环上的配位。通过LfSDR1@Rh-HP-TpBpy和Rh-HP-TpBpy的Rh 3d光谱的结合能如图5f所示，表明LfSDR1固定在Rh-HP-TpBpy上不影响Rh的化学状态。
之后作者通过能量色散光谱（EDS）图谱和共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）进一步确认LfSDR1的成功固定。LfSDR1@Rh-HP-TpBpy的元素映射图像显示了S元素的存在，而Rh-HP-TpBpy中不存在S元素，这表明LfSDR1已成功固定在Rh-HP-TpBpy上。罗丹明B标记的LfSDR1@Rh-HP-TpBpy在CLSM下显示出红色荧光，表明LfSDR1在Rh-HP-TpBpy框架中均匀分布。
随后作者以2-氯苯乙酮为模型底物，评估并优化了LfSDR1@Rh-HP-TpBpy的催化性能，目标产物为（R）-2-氯-1-苯乙醇，如下图a所示。优化了化学酶级联反应条件，包括pH、NADP浓度、助溶剂及其浓度。最佳条件为：异丙醇（5体积%）作为助溶剂，2 mM NADP，30℃，pH 5，反应时间4小时。在此条件下，LfSDR1@Rh-HP-TpBpy可高效催化反应，产物ee值高达99%。通过对照实验验证了甲酸盐和LfSDR1在反应中的必要性。甲酸盐或LfSDR1的缺失均导致产物缺失，表明集成化学生物催化剂中各组分的不可或缺性。
作者通过分子对接研究了LfSDR1、NADPH和2-氯苯乙酮之间的相互作用，以揭示酶模块的催化机制如下图b所示。2-氯苯乙酮位于活性口袋的空腔内，酪氨酸羟基与底物羰基氧原子的距离为3.4 A，NADPH的氢原子与底物羰基碳原子的距离为2.7 A，这为氢转移提供了有利条件。由于Y2O3和Y244的存在，底物的苯环位于活性口袋的较低位置。底物右侧为疏水性氨基酸，左侧为亲水性氨基酸，围绕活性氨基酸Y156，这种结构有助于LfSDR1的优异区域选择性。
作者进而研究了LfSDR1@Rh-HP-TpBpy对其他卤代芳基酮的催化性能，以验证其在手性卤代芳醇不对称合成中的广泛适用性。在最佳反应条件下，一系列卤代芳基酮被转化为相应的手性卤代醇，产率良好至优异（71-99%），ee值高（86-99%），如下图所示，表明LfSDR1@Rh-HP-TpBpy具有广泛的底物范围。将NADH依赖性氧化还原酶谷氨酸脱氢酶与Rh-HP-TpBpy级联，实现了谷氨酸的可逆氧化脱氨，生成α-酮戊二酸，产率达到40.6%，进一步证明了Rh-HP-TpBpy的NADH再生系统的多功能性。
最后作者评估LfSDR1@Rh-HP-TpBpy的可重复使用性和稳定性，如下图所示。LfSDR1@Rh-HP-TpBpy在6次运行后仍保持约60%的初始活性，显示出较高的稳定性，这归因于Rh复合物和LfSDR1的固定化。LfSDR1@Rh-HP-TpBpy的最佳pH和温度分别为pH 5和30℃，与游离LfSDR1相同。但其在更宽的pH和温度范围内表现出更高的催化活性，进一步证明了其稳定性。与游离LfSDR1和CLEA-LfSDR1相比，LfSDR1@Rh-HP-TpBpy展现出显著增强的热稳定性、机械稳定性和对酸碱环境的耐受性。通过圆二色光谱分析，发现固定化LfSDR1的二级结构中随机性降低，β折叠增加，表明其刚性增强，有助于提高稳定性。此外，HP-TpBpy的保护作用进一步提升了CLEA-LfSDR1的pH、热和机械稳定性。
总结：
受次级配位金属酶的启发，铑基分级多孔COF Rh-HP-TPBPy被用作人工NAD（P）H再生催化剂，表现出相当的催化性能（40分钟产率为83.5%）和对天然甲酸脱氢酶的更高稳定性。HP-TpBpy的大孔径不仅促进了传质，而且作为固定CLEA-LfSDR1的稳定载体，能够制备用于化学酶还原各种卤代芳基酮的集成催化剂，并产生相应的高转化率和ee值高达99%的手性芳醇。由于固定化金属催化剂和酶的高稳定性，这种集成的LfSDR1@RhHP-TpBpy表现出良好的再循环能力，并且在6次运行后仍然保持60%的初始催化活性。这项工作为涉及可回收金属配合物和酶的集成多相化学催化剂的制备提供了有益的见解，也揭示了分级多孔COFs可以作为空间分离和稳定的载体，用于金属和酶的共固定。这项工作还开发了一种高效且可回收的化学生物催化剂，用于手性卤代芳醇的不对称合成。
文章信息：
DOI: 10.1016/j.ijbiomac.2024.134641